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實(shí)驗(yàn)推薦——分子標(biāo)記技術(shù)AFLP
點(diǎn)擊次數(shù):2987 更新時(shí)間:2023-07-03

實(shí)驗(yàn)推薦——分子標(biāo)記技術(shù)AFLP

實(shí)驗(yàn)方法原理:

AFLP RFLPPCR兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合的產(chǎn)物,它既克服了 RFLP 技術(shù)復(fù)雜、有放射性危害 和 RAPD 穩(wěn)定性差,標(biāo)記呈現(xiàn)隱性遺傳的缺點(diǎn);同時(shí)具有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點(diǎn)。但它的技術(shù)費(fèi)用昂貴,對(duì) DNA 的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高。


其基本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組 DNA 產(chǎn)生不同大小的 DNA 片段,再使雙鏈人工接頭的酶切片段相連接,作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板 DNA,然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,最后在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加 1—3個(gè)選擇性核苷酸作引物對(duì)模板 DNA 基因再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,,然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳,多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長度不同被檢測(cè)出來。


AFLP 技術(shù)主要特點(diǎn) :分析所需DNA 量少,僅需 0.5g;可重復(fù)性好;多態(tài)性強(qiáng);分辨率高;不需要 Southern 雜交;樣品適用性廣;


AFLP 技術(shù)被認(rèn)為是一種十分理想、有效的分子標(biāo)記。

 

實(shí)驗(yàn)材料:

1.1           樣品保存與運(yùn)輸

樣品類型

樣品要求

植物材料

新鮮組織、葉片采用硅膠干燥后或干冰運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室

動(dòng)物材料

新鮮組織,無水乙醇封存低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室

DNA

干冰運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室

 

 

 

 

 

實(shí)驗(yàn)步驟:

1.2           DNA 提取(實(shí)驗(yàn)方法視DNA來源而異,此處以普通植物樣本為例)

CTAB法提取

1) 稱取材料50mg,液氮研磨三至四次

2) 將粉末放到裝有800µl 2×CTAB提取緩沖液的2ml離心管中

3) 加入60µl巰基乙醇混勻,60度預(yù)熱30min

4) 其間混勻二至三次取出樣品于室溫放置

5) 待樣品冷卻到室溫加入800µl氯仿:異戊醇(241

6) 振蕩混勻,12000rpm離心15min

7) 取上清到一新2ml離心管,加入等體積的氯仿:異戊醇(241),振蕩混勻,12000rpm離心15min

8) 取上清到一新2ml離心管中加入1.5倍體積1×CTAB沉淀液,放置20-30min12000rpm離心15min

9) 將沉淀晾干溶于200µl TE-buffer(溶解)

10)      加入400 µl 95% 乙醇,20µl  3M NaAC, -20 ℃ 沉淀1小時(shí)

11)      4℃ 離心,12000rpm離心15min

12)      500µl 75%乙醇洗滌,12000rpm離心10min

13)      加入30-50µl TE-buffer

14)      0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

備注CTAB法主要針對(duì)植物基因組DNA的提取,其它樣品:如動(dòng)物組織、細(xì)胞、菌體等公司有相關(guān)試劑盒。

 

1.3           限制性酶切及連接反應(yīng)

反應(yīng)體系


組分

對(duì)照(體積)

樣品(體積)

DNA模板(50ng/μl

4μl

4μl

Adapter

1μl

1μl

EcoR I/MseI 

2μl

2μl

10XReaction buffer

2.5μl

2.5μl

10mM ATP

2.5μl

2.5μl

T4 Ligase

1μl

1μl

H2O

7μl

7μl

混勻離心數(shù)秒 37℃保溫5h ,8℃保溫4h,4℃過夜。

-20℃保存,作為預(yù)擴(kuò)增模板

 

1.4  預(yù)擴(kuò)增

反應(yīng)體系

組分

體積

DNA

2μl

Pre-ampmix(預(yù)擴(kuò)引物)

1μl

dNTPs

1μl

10XPCR buffer

2.5μl

Taq

0.5μl

ddH2O

18μl


離心數(shù)秒,按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增

94  2min

       94  30S

       56  30S      30 cycles

      72  80S

    72  5min

    4

 

 

1.5 選擇性擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物1:20稀釋后作為選擴(kuò)模板

按以下體系混勻后,離心數(shù)秒

 

組分

體積

預(yù)擴(kuò)稀釋樣品

2μl

10XPCR buffer

2.5μl

dNTP  

0.5μl

EcoRI 引物

1μl(共8種)

MseI 引物

1μl(共8種)

Taq

0.5μl

ddH2O

17.5μl 

Total volum

25μl

 

按下列參數(shù)設(shè)置PCR循環(huán)

1)   第一輪擴(kuò)增參數(shù):94  30S  65  30S,  72  80S

2)   以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃,擴(kuò)增12輪。

3)   接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23

94  30S,

55  30S         23 Cycles

72  80S

4)  72   5min

 5 4



 


 

1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果

ABI377測(cè)序儀電泳檢測(cè)。數(shù)據(jù)通過GENESCAN軟件進(jìn)分析。

電泳圖譜


峰圖


原始數(shù)據(jù)


01數(shù)據(jù)

遺傳聚類圖


實(shí)驗(yàn)說明:

 

1.7 數(shù)據(jù)分析說明

1) ROX500分子量內(nèi)標(biāo)

      ROX500ROX紅色熒光標(biāo)記的分子量內(nèi)標(biāo),從小到大,片段大小依次為:70、80、90100、120140、160、180、190、200、220、240、260、280、300320、340、360、380、400425、450475、490、500bp),共25條帶。

2) 原始數(shù)據(jù)

  公司為客戶提供ABI377測(cè)序儀電泳檢測(cè)后的片段大小,即原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)是通過GENESCAN軟件進(jìn)分析,軟件每2個(gè)堿基讀一次數(shù),Marker片段范圍為 70-500bp,這樣在70-500 bp之間一共讀取216個(gè)數(shù),由于不可避免的誤差,在所設(shè)置的片段Bin Range范圍內(nèi)的片段,認(rèn)為是同一條帶,例如:在71.5-73.5 之間,c1 、c2擴(kuò)增條帶大小分別為73.00835 71.9044,這樣的誤差范圍在我們的誤差允許范圍認(rèn)為是同一條帶。

201數(shù)據(jù)

      在原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,有帶的地方替換為1,無帶的地方替換為0,這樣構(gòu)成了01數(shù)據(jù),同時(shí)給客戶發(fā)一份所有01數(shù)據(jù)匯總后的總數(shù)據(jù)。

由于軟件要求,我們一般都會(huì)給客戶把數(shù)據(jù)處理成NTSYSpc2.1 這個(gè)軟件要求的標(biāo)準(zhǔn)的01數(shù)據(jù)格式即01總數(shù)據(jù)。01總數(shù)據(jù)中 r1-r216 表示第一個(gè)引物,r217-r432 代表第二個(gè)引物和01分?jǐn)?shù)據(jù)一一對(duì)應(yīng)。

如: 一共有8個(gè)引物:a-1a-2、a-3b-1、b-2、c-1、d-1…….等,在總數(shù)據(jù)中按順序排列:

   R1-  r216 的數(shù)據(jù)為:a-1 這個(gè)引物的數(shù)據(jù)

   R217-r432 的數(shù)據(jù)位:a-2 這個(gè)引物的數(shù)據(jù)……..,以此類推。

 

常見問題:

 1)客戶委托公司做實(shí)驗(yàn)服務(wù),客戶需要做哪些工作?

    客戶只需提供實(shí)驗(yàn)材料,我們負(fù)責(zé)DNA提取及后續(xù)全部試驗(yàn)。收到樣品后,我們一般會(huì)給客戶做預(yù)實(shí)驗(yàn),根據(jù)客戶預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,客戶滿意度,決定是否安排后續(xù)實(shí)驗(yàn)。公司現(xiàn)有64個(gè)引物組合,全部為FAM熒光標(biāo)記,我們會(huì)從中篩選條帶清晰、多態(tài)性較好的引物組合給客戶。在開始正式實(shí)驗(yàn)前,客戶需支付課題服務(wù)一半的費(fèi)用,余款在公司給客戶發(fā)送最后一批數(shù)據(jù)前,一次結(jié)清。

2) 關(guān)于AFLP收費(fèi)價(jià)格

目前我們的基本價(jià)格是30個(gè)樣,6~8對(duì)引物,6000元,實(shí)驗(yàn)周期大約為20天,如果您樣品較多或引物組合較多,具體可協(xié)商。

3)條帶數(shù)太多

PCR產(chǎn)物在ABI測(cè)序儀上電泳,檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度要比銀染高的多,數(shù)據(jù)分析是通過GENESCAN軟件進(jìn)行分析,所以對(duì)于很弱的帶,如果人工統(tǒng)計(jì)的話,不會(huì)把這樣的帶統(tǒng)計(jì)進(jìn)去,但軟件分析的話,會(huì)讀到這樣的帶。所以通過測(cè)序儀檢測(cè)比銀染條帶數(shù)多,這個(gè)可以理解。另外我們一般通過控制熒光信號(hào)強(qiáng)度來控制條帶數(shù),對(duì)于擴(kuò)增強(qiáng)以及擴(kuò)增相對(duì)較弱的引物,通過控制熒光信號(hào)強(qiáng)度,盡量保證條帶數(shù)在50~60條,最大限度減少由于擴(kuò)增強(qiáng)度的問題,引起的條帶數(shù)的差異,最真實(shí)的反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4)能否找到所有差異帶的具體位置,并回收克隆差異條帶?

請(qǐng)參照提供數(shù)據(jù)結(jié)果中,原始數(shù)據(jù)部分,數(shù)據(jù)表中,每個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)都有片段大小,有帶的地方是片段的實(shí)際大小,無帶的為0,很容易找到差異帶。目前我們采取的熒光引物,跑測(cè)序膠,只能指出差異帶的具體位置及片段大小,不能夠回收克隆差異帶。

5)共有譜帶較少,多態(tài)性太高

   共有譜帶為所有樣品在某一位點(diǎn)擴(kuò)增后共有的條帶。因此只要有一個(gè)樣品的擴(kuò)增不好,或者在這個(gè)樣品無擴(kuò)增,就會(huì)導(dǎo)致共有普帶數(shù)較少或沒有。所以一定要保證實(shí)驗(yàn)材料新鮮,這樣我們才能夠保證后續(xù)試驗(yàn)中的PCR擴(kuò)增沒問題。如果樣品確實(shí)有問題,為了不影響整體數(shù)據(jù)要去除這類樣品。

 

鼎國產(chǎn)品推薦

DNA提取純化試劑盒

貨號(hào)

名稱

品牌

規(guī)格

市場價(jià)(元)


DNA提取




GV-CT-DNA-50/100

植物基因組DNA提取試劑盒(CTAB)

Genview

50T/100T

200/380

GV-AT-DNA-50/100

動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒

Genview

50T/100T

300/550

GV-WB-DNA-50/100

全血基因組DNA小量提取試劑盒

Genview

50T/100T

300/550

GV-B-DNA-50

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒

Genview

50T/100T

380/660

NEP001

離心柱型動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒

鼎國

50T/100T

300/550

NEP003

離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒

鼎國

50T/100T

400/750

NEP020

離心柱型禽類全血基因組DNA提取試劑盒

鼎國

50T/100T

360/660

NEP023

新型植物基因組DNA快速提取試劑盒

鼎國

50T/100T

280/500

NEP062

動(dòng)物組織/細(xì)胞/血液基因組DNA提取試劑盒

鼎國

50T/100T

350/600


DNA純化回收




GV-PCR-P-50/100

高效DNA片段回收試劑盒

Genview

50T/100T

180/350

GV-GX-50/100

高效DNA凝膠回收試劑盒

Genview

50T/100T

180/350

NEP013

離心柱型溶液/凝膠DNA回收試劑盒

鼎國

50T/100T

150/240

PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑

貨號(hào)

名稱

品牌

規(guī)格

市場價(jià)(元)

PER001-2

Taq   DNA Polymerase(10× Taq Buffer含有Mg2+)

鼎國

1000U(2U/μl)

180

PER007-1

2×Taq   PCR Green Mix

鼎國

1ml

120

PER013-2

通用型PCR試劑盒

鼎國

50T

200

GD1102-1ML

dNTPs   10 mM

Genview

1ml

90

PER019

10×PCR   buffer(含Mg2+

鼎國

1ml×10

80

PER018-2

雙蒸水ddH2O

鼎國

500ml

100

電泳相關(guān)試劑

貨號(hào)

名稱

品牌

規(guī)格

市場價(jià)(元)

GA05-100G

Agarose 瓊脂糖

Genview

100g

350

NEP031

5×TBE(粉劑)

鼎國

1L

100

GT1308

5×TBE(液體)

Genview

500ml

60

LU362-1KG

Urea    尿素

Genview

1kg

110

GD1305-250UL

DL2000 DNA Marker

Genview

50T

100

分子標(biāo)記類實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑

貨號(hào)

名稱

品牌

規(guī)格

市場價(jià)(元)

MMR001

AFLP試劑盒(EcoRI/MseI型)

鼎國

50T

3500

MMR001-4

AFLP試劑盒(EcoRI/MseI型)核心試劑

鼎國

50T

2500

MMR002

AFLP試劑盒(PstI/MseI型)

鼎國

50T

3500

MMR002-4

AFLP試劑盒(PstI/MseI型)核心試劑

鼎國

50T

2500

MMR003

AFLP試劑盒(Hind/MseI型)

鼎國

50T

3500

MMR003-4

AFLP試劑盒(Hind/MseI型)核心試劑

鼎國

50T

2500

MMR001-FISH

熒光標(biāo)記AFLP試劑盒(EcoRI/MseI型)

鼎國

50T

4500

MMR002-FISH

熒光標(biāo)記AFLP試劑盒(PstI/MseI型)

鼎國

50T

4500

MMR003-FISH

熒光標(biāo)記AFLP試劑盒(Hind/MseI型)

鼎國

50T

4500

實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器

貨號(hào)

名稱

品牌

規(guī)格

市場價(jià)(元)

BD-BGC1

藍(lán)光切膠儀

博弗瑞德

臺(tái)

3999

BD-BRV1

藍(lán)光實(shí)時(shí)觀測(cè)儀

博弗瑞德

臺(tái)

2499

DL-600C

雙穩(wěn)電泳儀

東林

臺(tái)

3360

DG-32A

瓊脂糖水平電泳槽

東林

臺(tái)

990