產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST
AFLP 是RFLP與PCR兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合的產(chǎn)物,它既克服了 RFLP 技術(shù)復(fù)雜、有放射性危害 和 RAPD 穩(wěn)定性差,標(biāo)記呈現(xiàn)隱性遺傳的缺點(diǎn);同時(shí)具有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點(diǎn)。但它的技術(shù)費(fèi)用昂貴,對(duì) DNA 的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高。
其基本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組 DNA 產(chǎn)生不同大小的 DNA 片段,再使雙鏈人工接頭的酶切片段相連接,作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板 DNA,然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,最后在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加 1—3個(gè)選擇性核苷酸作引物對(duì)模板 DNA 基因再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,,然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳,多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長度不同被檢測(cè)出來。
本 AFLP 技術(shù)主要特點(diǎn) :分析所需DNA 量少,僅需 0.5g;可重復(fù)性好;多態(tài)性強(qiáng);分辨率高;不需要 Southern 雜交;樣品適用性廣;
AFLP 技術(shù)被認(rèn)為是一種十分理想、有效的分子標(biāo)記。
1.1 樣品保存與運(yùn)輸
樣品類型 | 樣品要求 |
植物材料 | 新鮮組織、葉片采用硅膠干燥后或干冰運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室 |
動(dòng)物材料 | 新鮮組織,無水乙醇封存低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室 |
DNA | 干冰運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室 |
1.2 DNA 提取(實(shí)驗(yàn)方法視DNA來源而異,此處以普通植物樣本為例)
CTAB法提取
1) 稱取材料50mg,液氮研磨三至四次
2) 將粉末放到裝有800µl 2×CTAB提取緩沖液的2ml離心管中
3) 加入60µl巰基乙醇混勻,60度預(yù)熱30min
4) 其間混勻二至三次取出樣品于室溫放置
5) 待樣品冷卻到室溫加入800µl氯仿:異戊醇(24:1)
6) 振蕩混勻,12000rpm離心15min
7) 取上清到一新2ml離心管,加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1),振蕩混勻,12000rpm離心15min
8) 取上清到一新2ml離心管中加入1.5倍體積1×CTAB沉淀液,放置20-30min,12000rpm離心15min
9) 將沉淀晾干溶于200µl TE-buffer(溶解)
10) 加入400 µl 95% 乙醇,20µl 3M NaAC, -20 ℃ 沉淀1小時(shí)
11) 4℃ 離心,12000rpm離心15min
12) 500µl 75%乙醇洗滌,12000rpm離心10min
13) 加入30-50µl TE-buffer
14) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
備注:CTAB法主要針對(duì)植物基因組DNA的提取,其它樣品:如動(dòng)物組織、細(xì)胞、菌體等公司有相關(guān)試劑盒。
1.3 限制性酶切及連接反應(yīng)
反應(yīng)體系
組分 | 對(duì)照(體積) | 樣品(體積) |
DNA模板(50ng/μl) | 4μl | 4μl |
Adapter | 1μl | 1μl |
EcoR I/MseI | 2μl | 2μl |
10XReaction buffer | 2.5μl | 2.5μl |
10mM ATP | 2.5μl | 2.5μl |
T4 Ligase | 1μl | 1μl |
H2O | 7μl | 7μl |
混勻離心數(shù)秒 37℃保溫5h ,8℃保溫4h,4℃過夜。
-20℃保存,作為預(yù)擴(kuò)增模板
1.4 預(yù)擴(kuò)增
反應(yīng)體系
組分 | 體積 |
DNA | 2μl |
Pre-ampmix(預(yù)擴(kuò)引物) | 1μl |
dNTPs | 1μl |
10XPCR buffer | 2.5μl |
Taq 酶 | 0.5μl |
ddH2O | 18μl |
離心數(shù)秒,按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增
94℃ 2min
94℃ 30S
56℃ 30S, 30 cycles
72℃ 80S
72℃ 5min
4 ℃
1.5 選擇性擴(kuò)增
預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物1:20稀釋后作為選擴(kuò)模板
按以下體系混勻后,離心數(shù)秒
組分 | 體積 |
預(yù)擴(kuò)稀釋樣品 | 2μl |
10XPCR buffer | 2.5μl |
dNTP | 0.5μl |
EcoRI 引物 | 1μl(共8種) |
MseI 引物 | 1μl(共8種) |
Taq 酶 | 0.5μl |
ddH2O | 17.5μl |
Total volum | 25μl |
按下列參數(shù)設(shè)置PCR循環(huán)
1) 第一輪擴(kuò)增參數(shù):94℃ 30S, 65℃ 30S, 72℃ 80S
2) 以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃,擴(kuò)增12輪。
3) 接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪
94℃ 30S,
55℃ 30S 23 Cycles
72℃ 80S
4) 72℃ 5min
5) 4 ℃
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1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果
ABI377測(cè)序儀電泳檢測(cè)。數(shù)據(jù)通過GENESCAN軟件進(jìn)分析。
電泳圖譜
峰圖
原始數(shù)據(jù)
01數(shù)據(jù)
遺傳聚類圖
1.7 數(shù)據(jù)分析說明
1) ROX500分子量內(nèi)標(biāo)
ROX500為ROX紅色熒光標(biāo)記的分子量內(nèi)標(biāo),從小到大,片段大小依次為:70、80、90、100、120、140、160、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、425、450、475、490、500(bp),共25條帶。
2) 原始數(shù)據(jù)
公司為客戶提供ABI377測(cè)序儀電泳檢測(cè)后的片段大小,即原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)是通過GENESCAN軟件進(jìn)分析,軟件每2個(gè)堿基讀一次數(shù),Marker片段范圍為 70-500bp,這樣在70-500 bp之間一共讀取216個(gè)數(shù),由于不可避免的誤差,在所設(shè)置的片段Bin Range范圍內(nèi)的片段,認(rèn)為是同一條帶,例如:在71.5-73.5 之間,c1 、c2擴(kuò)增條帶大小分別為73.00835 和71.9044,這樣的誤差范圍在我們的誤差允許范圍認(rèn)為是同一條帶。
2)01數(shù)據(jù)
在原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,有帶的地方替換為1,無帶的地方替換為0,這樣構(gòu)成了01數(shù)據(jù),同時(shí)給客戶發(fā)一份所有01數(shù)據(jù)匯總后的總數(shù)據(jù)。
由于軟件要求,我們一般都會(huì)給客戶把數(shù)據(jù)處理成NTSYSpc2.1 這個(gè)軟件要求的標(biāo)準(zhǔn)的01數(shù)據(jù)格式即01總數(shù)據(jù)。01總數(shù)據(jù)中 r1-r216 表示第一個(gè)引物,r217-r432 代表第二個(gè)引物和01分?jǐn)?shù)據(jù)一一對(duì)應(yīng)。
如: 一共有8個(gè)引物:a-1、a-2、a-3、b-1、b-2、c-1、d-1…….等,在總數(shù)據(jù)中按順序排列:
R1- r216 的數(shù)據(jù)為:a-1 這個(gè)引物的數(shù)據(jù)
R217-r432 的數(shù)據(jù)位:a-2 這個(gè)引物的數(shù)據(jù)……..,以此類推。
1)客戶委托公司做實(shí)驗(yàn)服務(wù),客戶需要做哪些工作?
客戶只需提供實(shí)驗(yàn)材料,我們負(fù)責(zé)DNA提取及后續(xù)全部試驗(yàn)。收到樣品后,我們一般會(huì)給客戶做預(yù)實(shí)驗(yàn),根據(jù)客戶預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,客戶滿意度,決定是否安排后續(xù)實(shí)驗(yàn)。公司現(xiàn)有64個(gè)引物組合,全部為FAM熒光標(biāo)記,我們會(huì)從中篩選條帶清晰、多態(tài)性較好的引物組合給客戶。在開始正式實(shí)驗(yàn)前,客戶需支付課題服務(wù)一半的費(fèi)用,余款在公司給客戶發(fā)送最后一批數(shù)據(jù)前,一次結(jié)清。
2) 關(guān)于AFLP收費(fèi)價(jià)格
目前我們的基本價(jià)格是30個(gè)樣,6~8對(duì)引物,6000元,實(shí)驗(yàn)周期大約為20天,如果您樣品較多或引物組合較多,具體可協(xié)商。
3)條帶數(shù)太多
PCR產(chǎn)物在ABI測(cè)序儀上電泳,檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度要比銀染高的多,數(shù)據(jù)分析是通過GENESCAN軟件進(jìn)行分析,所以對(duì)于很弱的帶,如果人工統(tǒng)計(jì)的話,不會(huì)把這樣的帶統(tǒng)計(jì)進(jìn)去,但軟件分析的話,會(huì)讀到這樣的帶。所以通過測(cè)序儀檢測(cè)比銀染條帶數(shù)多,這個(gè)可以理解。另外我們一般通過控制熒光信號(hào)強(qiáng)度來控制條帶數(shù),對(duì)于擴(kuò)增強(qiáng)以及擴(kuò)增相對(duì)較弱的引物,通過控制熒光信號(hào)強(qiáng)度,盡量保證條帶數(shù)在50~60條,最大限度減少由于擴(kuò)增強(qiáng)度的問題,引起的條帶數(shù)的差異,最真實(shí)的反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4)能否找到所有差異帶的具體位置,并回收克隆差異條帶?
請(qǐng)參照提供數(shù)據(jù)結(jié)果中,原始數(shù)據(jù)部分,數(shù)據(jù)表中,每個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)都有片段大小,有帶的地方是片段的實(shí)際大小,無帶的為0,很容易找到差異帶。目前我們采取的熒光引物,跑測(cè)序膠,只能指出差異帶的具體位置及片段大小,不能夠回收克隆差異帶。
5)共有譜帶較少,多態(tài)性太高
共有譜帶為所有樣品在某一位點(diǎn)擴(kuò)增后共有的條帶。因此只要有一個(gè)樣品的擴(kuò)增不好,或者在這個(gè)樣品無擴(kuò)增,就會(huì)導(dǎo)致共有普帶數(shù)較少或沒有。所以一定要保證實(shí)驗(yàn)材料新鮮,這樣我們才能夠保證后續(xù)試驗(yàn)中的PCR擴(kuò)增沒問題。如果樣品確實(shí)有問題,為了不影響整體數(shù)據(jù)要去除這類樣品。
DNA提取純化試劑盒 | ||||
貨號(hào) | 名稱 | 品牌 | 規(guī)格 | 市場價(jià)(元) |
DNA提取 | ||||
GV-CT-DNA-50/100 | 植物基因組DNA提取試劑盒(CTAB法) | Genview | 50T/100T | 200/380 |
GV-AT-DNA-50/100 | 動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒 | Genview | 50T/100T | 300/550 |
GV-WB-DNA-50/100 | 全血基因組DNA小量提取試劑盒 | Genview | 50T/100T | 300/550 |
GV-B-DNA-50 | 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 | Genview | 50T/100T | 380/660 |
NEP001 | 離心柱型動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒 | 鼎國 | 50T/100T | 300/550 |
NEP003 | 離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒 | 鼎國 | 50T/100T | 400/750 |
NEP020 | 離心柱型禽類全血基因組DNA提取試劑盒 | 鼎國 | 50T/100T | 360/660 |
NEP023 | 新型植物基因組DNA快速提取試劑盒 | 鼎國 | 50T/100T | 280/500 |
NEP062 | 動(dòng)物組織/細(xì)胞/血液基因組DNA提取試劑盒 | 鼎國 | 50T/100T | 350/600 |
DNA純化回收 | ||||
GV-PCR-P-50/100 | 高效DNA片段回收試劑盒 | Genview | 50T/100T | 180/350 |
GV-GX-50/100 | 高效DNA凝膠回收試劑盒 | Genview | 50T/100T | 180/350 |
NEP013 | 離心柱型溶液/凝膠DNA回收試劑盒 | 鼎國 | 50T/100T | 150/240 |
PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑 | ||||
貨號(hào) | 名稱 | 品牌 | 規(guī)格 | 市場價(jià)(元) |
PER001-2 | Taq DNA Polymerase(10× Taq Buffer含有Mg2+) | 鼎國 | 1000U(2U/μl) | 180 |
PER007-1 | 2×Taq PCR Green Mix | 鼎國 | 1ml | 120 |
PER013-2 | 通用型PCR試劑盒 | 鼎國 | 50T | 200 |
GD1102-1ML | dNTPs (10 mM) | Genview | 1ml | 90 |
PER019 | 10×PCR buffer(含Mg2+) | 鼎國 | 1ml×10支 | 80 |
PER018-2 | 雙蒸水ddH2O | 鼎國 | 500ml | 100 |
電泳相關(guān)試劑 | ||||
貨號(hào) | 名稱 | 品牌 | 規(guī)格 | 市場價(jià)(元) |
GA05-100G | Agarose 瓊脂糖 | Genview | 100g | 350 |
NEP031 | 5×TBE(粉劑) | 鼎國 | 1L | 100 |
GT1308 | 5×TBE(液體) | Genview | 500ml | 60 |
LU362-1KG | Urea 尿素 | Genview | 1kg | 110 |
GD1305-250UL | DL2000 DNA Marker | Genview | 50T | 100 |
分子標(biāo)記類實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑 | ||||
貨號(hào) | 名稱 | 品牌 | 規(guī)格 | 市場價(jià)(元) |
MMR001 | AFLP試劑盒(EcoRI/MseI型) | 鼎國 | 50T | 3500 |
MMR001-4 | AFLP試劑盒(EcoRI/MseI型)核心試劑 | 鼎國 | 50T | 2500 |
MMR002 | AFLP試劑盒(PstI/MseI型) | 鼎國 | 50T | 3500 |
MMR002-4 | AFLP試劑盒(PstI/MseI型)核心試劑 | 鼎國 | 50T | 2500 |
MMR003 | AFLP試劑盒(HindⅢ/MseI型) | 鼎國 | 50T | 3500 |
MMR003-4 | AFLP試劑盒(HindⅢ/MseI型)核心試劑 | 鼎國 | 50T | 2500 |
MMR001-FISH | 熒光標(biāo)記AFLP試劑盒(EcoRI/MseI型) | 鼎國 | 50T | 4500 |
MMR002-FISH | 熒光標(biāo)記AFLP試劑盒(PstI/MseI型) | 鼎國 | 50T | 4500 |
MMR003-FISH | 熒光標(biāo)記AFLP試劑盒(HindⅢ/MseI型) | 鼎國 | 50T | 4500 |
實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器 | ||||
貨號(hào) | 名稱 | 品牌 | 規(guī)格 | 市場價(jià)(元) |
BD-BGC1 | 藍(lán)光切膠儀 | 博弗瑞德 | 臺(tái) | 3999 |
BD-BRV1 | 藍(lán)光實(shí)時(shí)觀測(cè)儀 | 博弗瑞德 | 臺(tái) | 2499 |
DL-600C | 雙穩(wěn)電泳儀 | 東林 | 臺(tái) | 3360 |
DG-32A | 瓊脂糖水平電泳槽 | 東林 | 臺(tái) | 990 |